Por fín esta semana ya ha llegado nuestro nuevo material para el in vitro. El material que se muestra en la siguiente fotografía es el básico para empezar con esta técnica, además necesitarás (como veremos más adelante) algunos productos químicos.
En la imagen se muestran tijeras de acero inoxidable, pinzas de acero inoxidable, probeta, tubos de polipropileno autoclavable, bote de pirex autoclavable (2L), medio de cultivo Murashige y skoog + vitaminas, agar (bote blanco), hormonas BAP (citoquininas y auxinas), antibacteriano y antifúngico PPM.
2. 1 mL solución BAP (prescindible, aunque ayuda mucho)
3. 1 mL solución PPM (prescindible, aunque ayuda mucho)
4. 30 gr de sacarosa (o azúcar)
5. 3 gr de medio Murashige & Skoog + vitaminas (liofilizado)
6. 7-8 gr de agar agar (gelificante)
En la imagen se muestran tijeras de acero inoxidable, pinzas de acero inoxidable, probeta, tubos de polipropileno autoclavable, bote de pirex autoclavable (2L), medio de cultivo Murashige y skoog + vitaminas, agar (bote blanco), hormonas BAP (citoquininas y auxinas), antibacteriano y antifúngico PPM.
A continuación, las soluciones PPM y BAP (antibacteriano/antifúngico y hormonas respectivamente). Aunque estas dos disoluciones no son obligatorias son muy recomentables ya que multiplican encarecidamente las probabilidades de éxito y la reducción de la contaminacion. Además, se utiliza solo 1 ml por 1L de medio de cultivo preparado.
Los tubos de propileno con base son de 50 ml, aunque autoclavables, lo que supone que una vez que han sido utilizados pueden volver a ponerse en la autoclave u reutilizarse. Vienen estériles, lo que supone una gran ventaja inicial.
Primero de todo se prepara el medio de cultivo. En este caso la receta es para 1 L y contiene lo siguiente:
1. Agua destilada2. 1 mL solución BAP (prescindible, aunque ayuda mucho)
3. 1 mL solución PPM (prescindible, aunque ayuda mucho)
4. 30 gr de sacarosa (o azúcar)
5. 3 gr de medio Murashige & Skoog + vitaminas (liofilizado)
6. 7-8 gr de agar agar (gelificante)
7. Añadir ácido (clorhídrico como el salfumán o acético como el vinagre) o base (sosa) para ajustar el pH entre 5'6 y 5'8.
Hay dos formas de empezar un cultivo in vitro, a partir de las semillas o a partir de un explante. En las semillas, aunque el crecimiento es rápido, es mucho más lento que a partir de un explante, no obstante tiene mas probabilidades de contaminarse debido al sustrato. En este caso nos hemos decidido partir a partir del explante:
Una vez cortada la hoja con fragmenteo de rizoma incorporado, procederemos a:
1. Lavado con agua destilada para eliminar los fragmentos de sustrato más grandes
2. Lavado con agua destilada para eliminar los restos de sustrato que pudieran quedar.
3. Etanol al 96% durante 1 minuto. Agitar
4. Peróxido de hidrógeno al 3% (solución comercial) durante 3-5 minutos
5. Lejía al 15% durante 6 minutos
6. Lavado con agua destilada durante 3-5 minutos para eliminar restos de lejía.
A continuación con el material previamente autoclavado procederemos a cultivar los fragmentos de Dionaea en los respectivos tubos de cultivo. En nuestro caso hemos cultivado Dionaea muscipula regular form, Dionaea muscipula Dentate, Dionaea muscipula "all red!, Dionaea muscipula "Sawtooth"
Ahora solo falta esperar a que el BAP y PPM hagan su efecto y las plantas empiecen a formar callo (conjunto de células indiferenciadas) y a crecer.
Para los que estén interesados en empezar con el in vitro y no quieran gastar mucho en material, o simplemente no saben como prepararlo, más adelante pondremos a la venta tubos de polipropileno con el medio preparado en su interior (con planta o sin).
El precio todavía no es definitivo pero rondará los 1,2 €/ unidad (sin planta)
Muy instrucitovo. Gracias.
ResponderEliminarMoi.